Zalévání objektů - Histologický atlas

ZALÉVÁNÍ OBJEKTŮ

Zalévání objektů

Po vyprání fixáže se objekty zalévají do médií, která umožňují pozdější práci na mikrotomu. Tkáňové bločky jsou po fixaci sami o sobě stále velmi měkké a křehké, aby získaly požadovanou konzistenci, je nutné je prosytit zalévacím médiem (Lüllmann-Rauch, 2012). Mezi nejčastěji používaná média patří parafín nebo jeho speciální úprava pro histologii zvaná paraplast, epoxidové pryskyřice, celoidin nebo želatina. Parafín se používá většinou při práci ve světelné mikroskopii, kdežto epoxidové pryskyřice jsou častější pro elektronovou mikroskopii (Junqueira et al., 1999). Zalévání do jednotlivých médií se liší jednak postupem a jednak pozdější prací na mikrotomu. Při práci na mikrotomu jsou vytvářeny většinou řezy o síle 5-8μm (Habrová, 1986).

Zalévání do parafínu

Nejčastěji používaným médiem ve světelné mikroskopii je parafín nebo paraplast. Jeho používání s sebou přináší celou řadu kladů a záporů. Zalévání zejména drobných objektů není nijak časově náročné, protože trvá pouze několik hodin. Na druhou stranu není vhodný pro objekty větší než 2cm, protože by jej nedokázal dostatečně prosytit. Jeho použití je dále nevhodné zejména pro tvrdší tkáně, jako jsou kosti, chrupavky, zuby, vazivo, šlachy, ale například i kůže. Tyto tkáně při zalití do parafínu ještě více ztvrdnou a nelze je prakticky vůbec krájet (Jírovec, 1958). Další nevýhodou spojenou s parafínem jako zalévacím médiem je teplota, při které se zalití uskutečňuje. Teplota nutná pro důkladné rozpuštění parafínu je 60°C, při této teplotě však již dochází k poškození některých jemných objektů. Dále pak odvodnění a následné prosycení parafínem způsobuje smršťování tkáně o 8-20% (Jírovec, 1958). Na druhou stranu parafín umožňuje vytvářet při krájení souvislou pásku, díky čemuž můžeme získat představu o kompletní stavbě orgánu (Habrová, 1986).

Vlastnímu zalití do parafínu předchází několik dalších kroků: odvodnění objektu, projasňování, prosycení parafínem a vlastní zalití parafínem.

1) Odvodnění objektu

Protože parafín je médium nemísitelné s vodou, je třeba objekty před zalitím odvodnit. Toho dosáhneme převedením tkání přes lázně se vzestupnou alkoholovou řadou. Tento postup umožňuje odvodnění tkáně při jejím co nejmenším smrštění. Habrová (1986) uvádí, že někteří autoři používají k odvodnění objektů pouze 96% alkohol, protože celá vzestupná alkoholová řada podle nich nepřináší dostatečné množství výhod a je proto nadbytečná. Pokud je však vzestupná alkoholová řada k odvodnění objektů použita, začíná se většinou na 70% koncentraci alkoholu a pokračuje se na 80% a 96% koncentraci, přičemž v některých případech je vhodné odvodňování začít na nižších koncentracích (Habrová, 1986). Doba nutná k odvodnění objektů se liší, záleží zejména na jejich velikosti čím větší objekt, tím delší doba je nutná k jeho odvodnění. Obecně lze říci, že objekty o velikosti 2 - 4mm je nutno ponechat v jednotlivých lázních 30 minut až 2 hodiny, 6 - 8mm 3 až 4 hodiny, 10 - 15mm 6 až 12 hodin (Jírovec, 1958). Pouze v případě 96% alkoholu je nutné omezit dobu odvodňování, aby nedošlo k ztvrdnutí tkáně (Habrová, 1986). V 80% alkoholu mohou být tkáňové bločky ponechány i několik týdnů, aniž by došlo k jejich poškození (Jírovec, 1958).

Důležitou roli při odvodňování objektů hraje množství alkoholu v jednotlivých lázních. K dokonalému odvodnění je preferován větší objem alkoholu a případná výměna jednotlivých lázní (Jírovec, 1958).

Habrová (1986) dále uvádí možnost použití methylbenzoátu k dokonalému odstranění veškerých zbytků vody. Případné použití methylbenzoátu může nahradit lázeň 96% alkoholu. Odvodňování v tomto případě není určeno časem, ale klesnutím objektu ke dnu nádoby a jeho projasnění.

2) Projasňování

Po odstranění vody z tkáňových bločků je třeba objekty prosytit látkou mísící se současně se zalévacím médiem, tedy parafínem, i alkoholem (Junquiera, 1999). Nejčastěji používaným rozpouštědlem je benzen. Používá se jednak z důvodu nižších nákladů a jednak díky příznivým vlastnostem (Jírovec, 1958). Mezi další rozpouštědla patří methylbenzoát a terpineol, které je možno použít na bločky odvodněné v alkoholu o nižší koncentraci a tkáň v nich na rozdíl od xylenu netvrdne a neláme se (Habrová, 1986).

V případě prosycování benzenem jsou bločky ponořeny do 2 – 3 lázní po dobu 10 – 15 minut (Habrová, 1986). Po prosycení benzenem se tkáň projasní, až zprůsvitní (Junquiera et al., 1999). V případě špatného odvodnění objektů se v jejich středu vytvoří mléčně bílé zakalení. Pokud dojde k této situaci, je nutné odvodňování zopakovat vrácením objektu zpět do absolutního alkoholu (Habrová, 1986).

3) Prosycení parafínem

K prosycení tkání parafínem se používá parafín speciálně k tomu určený. Běžný parafín je méně kvalitní a není k prosycování vhodný. Kvality potřebné pro histologii se u běžného parafínu dosáhne teprve opakovaným tavením při 70 – 80°C. Jírovec (1958) uvádí, že je vhodné takovýto parafín tavit opakovaně i několik týdnů, dokud nezíská světlehnědou barvu. Habrová (1986) k takto zbarvenému parafínu výsledně přidává ještě 5% včelího vosku. Komerčně dostupný speciální parafín pro histologii, tzv. paraplat je připraven k okamžitému použití a není nutné jej dále upravovat.

V histologii se běžně používají 3 základní typy parafínu. Jejich pečlivý výběr má nezanedbatelný význam. Tyto parafíny se liší jednak v teplotě tání a jednak v objektech, jež je vhodné do nich zalévat. Měkký parafín taje při teplotě 40 – 45°C a je vhodný k zalévání měkkých tkání. Střední parafín má bod tání v rozpětí teplot 50 – 58°C a v praxi je nejvíce využívaný, protože do něj lze zalít prakticky všechny běžné tkáně. Posledním typem parafínu je parafín tvrdý, který taje při teplotách vyšších než 58°C. Je vhodný zejména pro tvrdé tkáně a práci v místnostech s vyššími teplotami (Jírovec, 1958).

Prosycování objektu parafínem se skládá z několika kroků. Nejdříve bloček vložíme na 30 minut při 35 – 40°C do nasyceného roztoku parafínu v benzenu. Benzen pomalu rozpouští parafín, který pak může dobře pronikat do tkání. Poté následuje prosycování čistým parafínem, které probíhá v termostatu nebo ve vodní lázni.  První lázeň je zahřátá na teplotu o 2°C vyšší než je teplota tání parafínu, zde objekt necháme 2-3 hodiny. V druhé lázni je objekt ponechán 3-5 hodin a v poslední lázni 5-12 hodin (Habrová, 1986). Teplota parafínu by nikdy neměla překročit 60°C, v opačném případě se histologické řezy špatně barví. V čistém parafínu ponecháme tkáňové bločky až týden (Jírovec, 1958).

4)Vlastní zalití parafínem

K vlastnímu zalití objektů parafínem se používá čistý parafín. Rozehřátý parafín nakapeme do předem připravených nádobek a nahřátou pinzetou do nich přeneseme objekty z poslední parafínové lázně, v níž jsme tkáně prosycovali. Objekt zorientujeme tak, abychom při krájení na mikrotomu získali řezy v požadovaném směru. Nádobku se stále ještě rozehřátým parafínem vložíme až po okraj do studené vodní lázně (10–15°C). Teplotu vodní lázně je třeba dodržet, při použití příliš chladné vody dochází k rozpraskání parafínového bločku. Ve chvíli, kdy se na povrchu rozehřátého parafínu vytvoří tuhá vrstvička, ponoříme celou nádobku pod vodu a necháme úplně zatvrdnout (Habrová, 1986). V případě, že parafín není na povrchu dostatečně zatuhlý, hrozí proniknutí vody do bločku a tak jeho znehodnocení. Nádobky s parafínem potápíme ve studené lázni proto, že parafín musí zatvrdnout velikou rychlostí. Při pomalém tuhnutí dochází buďto k hrubé krystalizaci parafínu a bločky se poté nedají krájet (Jírovec, 1958) nebo bloček obsahuje dutinu s měkkým, bílým parafínem (Habrová, 1986).

Kromě výše zmíněných se při zalévání objektů do parafínu můžeme dopustit celé řady dalších chyb, které později způsobují problémy při krájení preparátů na mikrotomovém noži. V případě použití nekvalitního parafínu vzniká bělavý a drobivý bloček. Pokud z parafínu nebylo dostatečně odstraněno rozpouštědlo, tedy benzen, vznikne měkký a bělavý bloček. Důležité je také dbát na velikost nádobky, do které tkáňové bločky zaléváme. Pokud jsou použity příliš velké nádobky, po zatuhnutí vzniká v centru bločku hluboká proláklina. Pokud jsme tkáň nedostatečně odvodnili ve vzestupné alkoholové řadě nebo nedokonale prosytili parafínem, bude při krájení z parafínu tkáň vypadávat. Mezi další problémy, se kterými se můžeme při práci s tkání setkat, patří její křehkost a tvrdost, takovém případě došlo k nedostatečnému odstranění některého z předcházejících médií. V posledním případě může docházet ke smršťování tkáně a její špatné barvitelnosti. To je známkou použití příliš vysoké teploty při prosycování a zalévání objektu do parafínu (Habrová, 1986).