Hlavní nabídka
BARVENÍ ŘEZOVÝCH PREPARÁTŮ
Tkáňové histologické řezy mají tloušťku pouze několik mikrometrů, zpravidla v rozmezí 5-
Rozdělení barviv
Chemické mechanismy, jejichž prostřednictvím dochází k barvení tkání, se u mnoha barviv doposud nepodařilo dostatečně objasnit. Většina barviv však tvoří elektrostatické vazby s ionizovatelnými radikály tkání (Junqueira et al., 1999). Podle povahy náboje barviva a náboje tkáně rozlišujeme dva základní typy barviv:
Kationtová (=bazická)
Kationtová barviva mají kladný náboj a elektrostatickými silami se váží na záporně nabité částice barvených tkání, jako například DNA nebo RNA. Kationtová barviva se řadí mezi zásadité (bazické) sloučeniny.
Mezi bazická barviva patří například hematoxylin, toluidinová modř, methylová zeleň nebo bazický fuchsin. Bazická barviva se využívají k barvení buněčných jader. Nejčastěji používaným bazickým barvivem je hematoxylin, který barví buněčná jádra a cytoplasmu bohatou na hrubé endoplasmatické retikulum (Mescher, 2010). Při barvení histologických preparátů je používána oxidační forma hematoxylinu hematein, který s trojmocnými ionty Al 3+, Fe 3+, Cr 3+ vytváří komplexní sloučeniny. Podle iontu, na který se hematoxylin váže, rozlišujeme hemalaun (Al 3+), železitý hematoxylin (Fe 3+) a chromový hematoxylin (Cr 3+) (Lüllmann-
Aniontová (=kyselá)
Aniontová barviva mají záporný náboj a elektrostatickými silami se váží na kladně nabité částice barvených tkání, jako například hemoglobin, mitochondrie nebo cytoplasmatické proteiny. Na pH stupnici se aniontová barviva řadí mezi kyselé sloučeniny.
Mezi kyselá barviva patří například eozin, erytrozin, oranž G, světlá zeleň nebo kyselý fuchsin. Nejčastěji používaným kyselým barvivem je však eozin. Využívá se pro barvení cytoplasmy a bazických částí cytoplazmatických proteinů (Junqueira et al., 1999).
Jednotlivá barviva jsou používána různými způsoby, právě podle způsobu jejich použití můžeme rozlišit různé typy barvení:
1) Progresivní
Progresivní barvení je založeno na předpokladu, že na některé tkáňové struktury se jednotlivá barviva váží různou rychlostí. Preparáty se proto barví tak dlouho, dokud není dosaženo optimálního zbarvení u všech struktur (Habrová, 1986).
2) Regresivní
Při regresivním barvení obarvíme rovnoměrně celý preparát tak, aby byly zvýrazněny všechny struktury. Barvíme tedy delší dobu. Přebytek barviva pak z tkáně odstraníme oplachem neboli diferenciací (Habrová, 1986).
3) Sukcedánní
V průběhu sukcedánního barvení dochází k barvení histologických preparátů více barvivy po sobě, přičemž každé ze zvolených barviv barví jinou složku tkáně (Habrová, 1986).
4) Simultální
Stejně jako při sukcedánním barvení dochází při simultálním barvení k barvení tkání několika barvivy, které barví rozdílné části tkání. Při simultálním barvení jsou však tkáně barveny několika barvivy najednou (Habrová, 1986).
5) Substantivní
Histologický preparát je barven barvivem přímo (Habrová, 1986).
6) Adjektivní
Tkáň histologického preparátu je barvena za použití mořidla (Habrová, 1986).
Postup barvení
Histologické řezy nakrájené na mikrotomu jsou zalité v parafínu, který je třeba z řezů odstranit, protože barviva, jako například eozin, jsou rozpustná ve vodě nebo v alkoholu, a tudíž s parafínem nemísitelná. Parafín se z řezů odstraňuje za pomocí sestupné alkoholové řady, která začíná xylenem a končí destilovanou vodou.
Xylen I.
Xylen II.
Propanol 100%
Ethanol 96%
Ethanol 80%
Destilovaná voda
Převod řezů do vody se provádí v uzavřených skleněných kyvetách, na jejichž vnitřní straně jsou drážky, které umožňují uchycení preparátů v pravidelných vzdálenostech a zabraňují tak jejich slepení. V předem stanovených časových intervalech jsou jednotlivá podložní skla za pomoci pinzety převáděna z jednoho roztoku do druhého. Současně je žádoucí pokud možno co nejvíce omezit vzájemné míchání jednotlivých roztoků. To je prováděno okapáním skel nebo otřením spodní hrany buničinou. Je důležité, aby skla v každém momentě byla vlhká, protože jejich oschnutí by vedlo ke zničení celého preparátu (Habrová, 1986).
Po převodu preparátů do vody je možno započít samotné barvení v barvivech zvolených podle předem stanovených požadavků. Po obarvení jsou řezy většinou uzavírány do kanadského balzámu, který je schopen preparáty zachovat desítky let. Kanadský balzám není mísitelný s vodou, ale s xylenem, proto je nutné obarvené řezy před zamontováním převést vzestupnou alkoholovou řadou zpět do xylenu.
Do kanadského balzámu se preparát montuje po vyjmutí z poslední xylenové lázně. Balzám je kápnut na podložní sklo s řezy a přikryt dostatečně velkým krycím sklem. Pokud dojde v balzámu k vytvoření bublin vzduchu, je vhodné preparáty umístit na předehřátou ploténku nebo do termostatu nastaveného na rozmezí teplot 40 – 50°C. Zde jsou řezy ponechány, dokud nedojde k zaschnutí kanadského balzámu (Jírovec, 1958).