Hlavní nabídka
ZHODNOCENÍ PRÁCE
Jedním z cílů této práce je ověřit v praxi vybranou techniku přípravy trvalých histologických preparátů. Jedná se o komplexní a složitý proces, v jehož průběhu může nastat celá řada komplikací (viz. kapitola 2.3.6. Krájení řezů na mikrotomovém noži). V následující kapitole jsou proto zhodnoceny vybrané pasáže laboratorních prací, zejména pak úskalí, se kterými jsem se osobně setkala.
V průběhu práce jsem zhotovila dohromady přes 300 preparátů vytvořených z následujících orgánů: plíce, kůže, srdce, brzlík, slezina, nadvarle, varle, penis, semenné váčky, příčně pruhovaná svalovina, srdeční svalovina, hladká svalovina, játra, jazyk, slinivka břišní, tenké střevo, tlusté střevo, žlučník, ledvina, močový měchýř, močová trubice a mozek. Trvalý histologický preparát mozku krysy potkana mi byl zapůjčen Katedrou buněčné biologie PřF UK v Praze. V rámci fotodokumentace bylo zhotoveno přes 100 fotografií zachycujících preparáty za použití různých zvětšení (40x, 100x, 200x, 400x).
Pitva
Pitva samotná proběhla bez větších obtíží. K manipulaci s myší domácí (Mus musculus) jsem použila oční chirurgické nůžky, skalpel, měkkou entomologickou a tvrdou chirurgickou pinzetu.
Při preparaci jednotlivých orgánů jsem použila měkkou entomologickou pinzetu. Důvodem tohoto výběru byla snaha o co nejmenší poškození tkání. Některé orgány, zejména pak játra nebo plíce byly velmi křehké a snadno se rozpadaly. Při vyjímání jater z břišní dutiny jsem k přestřižení vazivových závěsů použila oční chirurgické nůžky, protože při použití skalpelu byla nutná větší manipulace s pinzetou a docházelo k poškození tkáně. Při manipulaci s plícemi bylo zapotřebí velké opatrnosti, i ten nejmenší tlak způsoboval tvorbu hematomů.
Při preparaci trávicí soustavy jsem celou soustavu vyjmula z břišní dutiny a přenesla do samostatné misky. Jako nejobtížnější se ukázalo rozmotání střev. Nejrychlejším způsobem provedení tohoto kroku bylo uchopení konce jícnu pinzetou, v místě jeho protnutí před žaludkem, a pomalý rovnoměrný tah vpřed. Takto se jednotlivé kličky rozmotávaly prakticky samy a nutnost použití skalpelu byla minimální.
Tvorba řezových preparátů
Při fixaci tkání a jejich zalévání do parafínu se nevyskytly žádné potíže. První problémy se nastaly teprve v průběhu krájení tkáňových bločků na mikrotomovém noži. V kapitole 2.3.6. této diplomové práce je uvedeno devět základních chyb, se kterými se můžeme při práci na mikrotomu setkat. Osobně jsem řešila problémy spojené s následujícími chybami:
1) Řezy se na noži svinují v úzké ruličky.
Podle Habrové (1986) tento problém může nastat, pokud řežeme příliš silné řezy nebo byl na zalití použit příliš tvrdý parafín. Osobně jsem se s touto chybou setkala pouze u některých tkání, proto jsem vyloučila problém na straně parafínu. Snížení síly řezů se však ukázalo jako neúčinné. Abych dosáhla rozvinutí řezů, nechala jsem podložní skla natřená glycerolbílkem a zakápnutá destilovanou vodou nahřát na histologické ploténce. Svinuté řezy jsem přenášela po jednom z mikrotomového nože pomocí štětečku do kapky ohřáté vody. Tímto způsobem jsem dosáhla téměř okamžitého rozvinutí řezů.
2) Řezy ulpívají na parafínovém bločku při zpětném tahu nože.
Pouze v některých případech docházelo k ulpívání řezů na parafínovém bločku při zpětné tahu mikrotomového nože. Habrová (1986) jako příčinu tohoto problému uvádí nečistoty na noži nebo jeho špatné nabroušení. V mém případě byl mikrotomový nůž nově nabroušen před započetím práce, proto postačilo jeho otření buničinou napuštěnou benzenem.
3)Řezy netvoří souvislou pásku.
S tímto problémem jsem se při práci setkávala poměrně často. Podle literatury (Habrová, 1986) je příčinou tohoto jevu příliš tvrdý parafín, špatné seříznutí bločku nebo příliš silné řezy. Osobně jsem však absenci tvorby souvislé pásky nevnímala jako problém a jednotlivé řezy jsem řadila manuálně na podložním sklíčku, dosáhla jsem tím obdobného výsledku.
4) Objekt z řezu vypadává.
S tímto jevem jsem se setkala pouze v jediném případě a to při krájení varlete. Habrová (1986) přičítá příčinu nedostatečnému odvodnění objektu ve vzestupné alkoholové řadě. Pro samotnou tvorbu trvalých histologických preparátů však tato chyba nepředstavovala problém, protože při vypadávání nedošlo k poškození samotné tkáně.
Mezi další problémy, se kterými jsem se setkala, byly potíže spojené s řezáním kůže a použitím lepicího média. Problém s tvorbou kožních preparátů byl zpětně připočítán na vrub použití parafínu jako zalévacího média. Kůže se jevila jako příliš tvrdá, při krájení docházelo k jejímu narušení a trhání okolního parafínu. S obdobným problémem jsem se setkala pouze při tvorbě příčných řezů ocasem. V tomto případě jsem si však byla vědoma, že parafín není zalévací médium vhodné pro tvorbu řezů chrupavkou nebo kostí. Po dalším studiu literatury (Jírovec, 1958) se ukázalo, že kůže se řadí po bok výše uvedených tkání jako nevhodná k zalévání do parafínu. Důvodem je přílišné tvrdnutí tkání.
K lepení řezů na podložní skla jsem použila glycerolbílek vlastní výroby nebo roztok želatiny zapůjčený z Katedry buněčné biologie Přírodovědecké fakulty UK v Praze. Použití obou těchto médií s sebou přináší určité klady a zápory. Nesporným přínosem při použití želatiny je fakt, že u ní dochází pouze k minimálnímu barvení v průběhu barvení řezů. Nevýhodu představovala skutečnost, že jednotlivé řezy po přenesení do destilované vody nezůstaly na místě, ale docházelo k jejich neustálému pohybu. Vyrovnat je do řady se ukázalo jako téměř nemožné. Na druhou stranu glycerolbílek se částečně barví společně s řezy, které ale po jejich přenesení do destilované vody zůstávají na místě. Při snaze o určitou kompenzaci záporných vlastností gylcerolbílku se mi osvědčilo používání pouze čerstvě připraveného roztoku (max. 1 -