Zalití do parafínu - Histologický atlas

ZALITÍ DO PARAFÍNU

Odvodnění objektu

Parafín je médium nemísitelné s vodou, proto je naprosto nezbytné tkáňové bločky před zalitím do parafínu důkladně odvodnit. Toho jsem dosáhla vzestupnou alkoholovou řadou. Jelikož v předchozím kroku, jsem objekty vyprala v 70% ethanolu, mohla jsem alkoholovou řadu začít na 80% ethanolu. Při odvodňování tkáňových bločků jsem brala v úvahu jejich velikost, čím je bloček větší, tím delší dobu musí být uložen v jednotlivých roztocích. Zároveň však nesmí jednotlivé bločky zůstat zejména v 96% ethanolu a 100% isopropanolu (v původní receptuře se uvádí ethanol, který je však nutné předem odvodnit pomocí vyžíhané ho síranu měďnatého) příliš dlouho, aby nedošlo k tvrdnutí tkáně.

Projasňování

Tkáňové bločky jsem přenesla ze 100% isopropanolu do 2-3 benzenových lázní, v nichž byly ponechány vždy 10-15 minut. Tkáň se díky benzenu postupně projasní, u menších vzorků až zprůsvitní.

Prosycení parafinem

Odvodněné tkáňové bločky se prosycují parafínem postupně v několika krocích. Nejdříve jsem tkáňové bločky přenesla z benzenu do lázně připravené smícháním parafínu a užitého rozpouštědla, tedy benzenu. Tento krok trvá minimálně 30 minut a provádí se v termostatu při 46°C.

V dalším kroku jsem přenesla objekty postupně do 3 lázní čistého parafínu. V těchto jednotlivých lázních zůstávají objekty až 8 hodin. Prosycení parafínem se uskutečňuje v termostatu při 56°C, aby byl parafín v kapalném stavu.

Vlastní zalití do parafinu

Tkáňové bločky prosycené parafínem jsem zalévala do čistého parafínu, ve kterém jsem je posléze krájela na mikrotomu. Vzhledem k malé velikosti tkáňových bločků můžeme k vlastnímu zalití použít například plastová víčka od lékovek nebo od krabiček fotografického filmu. Objekty jsem uložila do víček a orientovala podle toho, jakým směrem jsem plánovala jednotlivé bločky krájet. Zalila jsem je čistým parafínem, na povrchu jsem nechala parafín zatuhnout a poté jsem celé víčko ponořila do lázně se studenou vodou, aby parafin ztuhl v amorfním stavu a nestihly se vytvořit krystalky.