Hlavní nabídka
FIXACE TKÁNĚ
Dalším krokem v přípravě histologických řezů je fixace odebrané tkáně. Důvodem fixace je rychlé usmrcení buněk, čímž se zabrání denaturaci bílkovin a autolytickým pochodům, ke kterým dochází po smrti organismu. Fixace probíhá za pomocí fixační tekutiny, na níž jsou kladeny nemalé požadavky. Tekutina musí dostatečně rychle pronikat do odebrané tkáně, proto je nutné odebírat poměrně malé bločky tkáně, nesmí měnit strukturu buňky a musí zachovávat barvitelnost tkání. Na výběr máme z široké škály fyzikálních a chemických fixačních prostředků, bohužel žádný z daných způsobů nikdy nedokáže dokonale splnit všechny požadavky kladené na fixační tekutinu (Habrová, 1986). Při fixaci dojde vždy alespoň k částečné změně struktury fixovaných buněk, fixace samotná je založená na trvalém srážení buněčných koloidů, hlavně bílkovin (Jírovec, 1958). Záleží proto na vhodné volbě fixace, aby se strukturální změny omezily na minimum.
Postup fixace
Vzhledem k malým rozměrům fixované tkáně, zhruba 0,5cm, může fixace probíhat ve zkumavce nebo v epruvetě. Dno nádoby vysteleme chomáčkem vaty nebo gázy tak, aby vložená tkáň nebyla v kontaktu se dnem a fixační tekutina mohla k tkáni snadněji prostupovat. Pokud by fixovaná tkáň byla ve styku se skleněným dnem, místo kontaktu by bylo nedostatečně profixováno. V případě použití fixážních tekutin s obsahem alkoholu zabraňuje vata umístěná na dně ředění fixáže vodou, která se uvolňuje z tkáně a klesá ke dnu. K fixáži přistupujeme okamžitě po odběru tkáně z organismu, aby se zabránilo strukturálním změnám buněk, případně i hnilobným dějům. K fixáži je nutné dostatečné množství tekutiny, udává se spotřeba až 50x většího objemu, než je objem fixované tkáně (Habrová, 1986). V některých případech se doporučuje fixovat vzorky tkání v ledničce při teplotách 4-
Fyzikální fixační prostředky
Fyzikální fixační prostředky nejsou v histologii příliš používány. Mezi fyzikální fixační prostředky patří fixace teplem, vysycháním nebo zmrazením. Fixace vysycháním se v histologii využívá při tvorbě krevních roztěrů. V tomto případě je však samotná fyzikální fixace nedostačující a je potřeba použití i chemických fixačních prostředků.
Fixace zmrazením je pravděpodobně nejšetrnější způsob fyzikální fixace. K hlubokému zmrazení dochází za použití tekutého dusíku o teplotě -
Chemické fixační prostředky
Chemické fixační prostředky se používají v histologii častěji, než fixační prostředky fyzikální. Celkově je možné chemické fixační látky rozdělit do pěti hlavních skupin:
1) Minerální kyseliny
2) Soli kovů
3) Organické kyseliny
4) Organické redukční prostředky
5) Směsné fixační tekutiny
Jedná se tedy o chemické prostředky anorganického nebo organického původu. Při fixaci je možné tyto prostředky používat samostatně, ale většina z nich má vedle nezanedbatelných předností také celou 000řadu, v histologii nežádoucích vedlejších účinků, které znemožňují jejich samostatnému použití. Nežádoucí vedlejší efekty se snažíme potlačit vytvářením směsí, takzvaných fixačních tekutin.
Minerální kyseliny
Oxid osmičelý je chemický fixační prostředek anorganického původu, který se používá ve formě par nebo roztoků. Tvoří bezbarvé hygroskopické krystalky, které se rozpouštějí ve dvakrát destilované vodě a uchovává se v čistých skleněných lahvích se zábrusovou zátkou (Jírovec, 1958). Tkáně dokáže fixovat bez tvorby sraženin a při dalším zpracování pomáhá tkáň udržet odolnou proti smršťování, ale jeho velkou nevýhodou je jeho nízká pronikavost a snížená barvitelnost tkání. Tato fixační látka se používá k fixaci cytoplazmy, lipidů nebo Golgiho aparátu, který se jejím vlivem obarvuje na černo (Habrová, 1986).
Oxid chromový je anorganický chemický fixační prostředek většinou používaný ve směsi s K 2Cr 2O 7, který umožňuje lepší pronikavost a barvitelnost fixovaných tkání (Habrová, 1986). Tvoří červené, silně hygroskopické krystalky (Jírovec, 1958).
Soli kovů
Chlorid rtuťnatý se používá ve formě par. Přestože, stejně jako velké množství sloučenin rtuti, i chlorid rtuťnatý je jedovatý, patří mezi nejpoužívanější chemické fixační prostředky anorganického původu z řad solí těžkých kovů (Habrová, 1986). Je rozpustný ve studené vodě v poměru 7:100, jeho rozpustnost ve studeném alkoholu nebo v teplé vodě je mnohonásobně lepší. Jeho nevýhodou je nízká pronikavost do tkání, která se však kompenzuje použitím dalších činidel. Jeho výhodou je výborná fixace jádra a zachování barvitelnosti tkání. Jeho sraženiny se z tkání vypírají v 80% alkoholu obarveném Lugolovým roztokem, který způsobuje slabě hnědé zabarvení (Jírovec, 1958).
Dichroman draselný je fixační prostředek využívaný pouze ve směsích, např. se používá ve směsi s oxidem chromovým (CrO 3), u kterého vylepšuje pronikavost a barvitelnost tkání. Samostatně se vyznačuje špatnou fixací jádra.
Organické kyseliny
Ledová kyselina octová je bezbarvá kapalina o koncentraci 100%, která již při 17°C krystalizuje. V koncentrovaném stavu se kyselina octová používá zředěná 4% vody. Proto se používá jako součást směsí, kde pomáhá urychlovat fixační schopnosti jiných fixačních činidel. Sama se vyznačuje výbornou pronikavostí do tkání díky své kyselé reakci, ale na druhou stranu narušuje některé buněčné organely, např. mitochondrie, sráží hlen nebo nabobtnává kolagen (Jírovec, 1958).
Kyselina trichloroctová stejně jako ledová kyselina octová rychle proniká do tkání, na rozdíl od ní udržuje nenarušené mitochondrie, ale kolagen v její přítomnosti bobtná stejně jako v ledové kyselině octové (Jírovec, 1958). Dále se využívá při tvorbě řezových preparátů z kostí. Používá se k jejich dekalcifikaci (Habrová, 1986). Kyselina trichloroctová je silně hygroskopická, tvoří krystalky, které se při kontaktu se vzduchem roztékají a jsou dobře rozpustné ve vodě nebo v alkoholu (Jírovec, 1958).
Kyselina pikrová je fixační látka srážející bílkoviny. Její nevýhodnou je, že tkáně zabarvuje do žluta, ale tento efekt je možno zvrátit pomocí 10% (Li 2CO 3), který obarvenu tkáň odbarvuje (Habrová, 1986).
Organické redukční prostředky
Ethanol se nejčastěji využívá ve směsích. Při dlouhodobé fixaci se snižuje barvitelnost tkání a jemné buněčné struktury se v něm smršťují. Nejčastěji se využívá směs denaturovaného ethanolu s 2% benzenem nebo benzínem. Výhodou denaturovaného ethanolu je jeho větší cenová dostupnost, protože čistý ethanol je velice nákladný a pro fixaci je nutné používat minimálně roztok o koncentraci 70% (Jírovec, 1958).
Methylalkohol je jedovatý, v praxi se většinou používá hlavně k fixaci krevních roztěrů.
Fromaldehyd se používá jako vodný roztok 35 – 40% formaldehydu, který se přidává do fixačních tekutin nebo také samostatně jako 4 – 10% roztok. Je jedním z nejpoužívanějších fixačních prostředků v histologii, ale také se používá při fixaci celých menších živočichů. Je možné jej používat samostatně, jinak se také vyskytuje jako součást fixačních tekutin. Jeho výhodou je dobré srážení bílkovin, zachovávání mitochondrií, nerozpouští tuky a tkáně je v něm možné uchovávat delší dobu (Habrová, 1986). Postupem času se na dně lahve s formaldehydem sráží nerozpustný paraldehyd, jehož přítomnost snižuje hodnotu celého obsahu lahve. Jeho nevýhodou je dále tvorba kyseliny mravenčí, která se v něm v průběhu času vytváří, především pokud je vystaven přímému slunečnímu světlu. Kyselinu mravenčí můžeme z formaldehydu odstranit přisypáním práškového uhličitanu vápenatého, kterých na sebe kyselinu naváže, a zředěním vodovodní vodou, nikoliv destilovanou vodou (Jírovec, 1958).
Směsné fixační tekutiny
Jak již bylo řečeno výše, fixační tekutiny jsou speciálně sestavené tak, aby se dosáhlo maximálního potlačení negativních efektů jednotlivých fixačních činidel za současné podpory jejich kladných vlastností. Fixačních tekutin existuje několik různých typů, ze kterých je možno vybírat podle toho jaké požadavky klademe na konečný preparát. Mezi nejčastěji používané patří Bouinova fixační tekutina, Zenkerova fixační tekutina nebo Carnoyova fixační tekutina. Jako samostatnou fixační tekutinu je možné použít i formaldehyd, který je také používán jako součást směsí jiných fixačních tekutin.
Nejčastěji používanou fixační tekutinou je Bouinova fixáž, která se připraví smícháním 150ml kyseliny pikrové, 50ml 40% formaldehydu a 10ml ledové kyseliny octové. Doba fixace závisí na velikosti objektu, pohybuje se však v rozmezí od 2 do 48 hodin (Lelláková et al., 1985)
Vypírání fixačních tekutin z objektů
Vypírání většiny fixačních tekutin před další úpravou preparátů je nezbytně nutné. Přítomnost fixační tekutiny v tkáních by stěžovala další úpravu vzorků. Nejčastěji způsobuje potíže při zalévání tkání do parafínu nebo snižuje pozdější barvitelnost řezů. K vypírání většinou používáme alkohol nebo vodu. Aby bylo vypírání fixáže dokonalé je nutné alkoholové i vodní lázně několikrát vyměnit a dodržovat předepsanou dobu a postup vypírání stanovený pro jednotlivé fixáže. Alkoholem většinou vypíráme fixáž v zábrusových skleněných váženkách. Vodou vypíráme v kádinkách, ve kterých jsou vzorky zavěšené v gázovém váčku nebo ve speciálních porcelánových nádobkách (Habrová, 1986).