Barvení řezů - Histologický atlas

BARVENÍ

K barvení řezů jsem použila dvě barvící techniky: Harrisův hematoxylin-eosin (HE) a Massonův trichrom (MT). HE se používá k barvení orientačních histologických řezů, modře barví buněčná jádra a růžově plasmu. MT se svými barvícími vlastnostmi velice podobá HE, navíc však barví zeleně vazivo a chrupavku a červeně kost.

K barvení jsem použila sadu kyvet. Každá kyveta byla naplněna příslušným roztokem (viz. níže). Jednotlivé preparáty jsem přenášela z roztoku do roztoku po uplynutí přesně stanoveného času pomocí pinzety. Aby byla omezena kontaminace jednotlivých roztoků, nechala jsem každé podložní sklo vždy lehce okapat a spodní hranu jsem otřela buničinou. Je však nezbytné dávat pozor, aby skla nikdy neuschla, protože by došlo k poškození řezů.

Při oplachování řezů ve vodovodní vodě jsem řezy nejdříve přenesla do naplněné kyvety, kterou jsem po zmodrání vody vylila. Na stěnu prázdné kyvety (pouze s podložními skly) jsem pak soustředila slabý proud vodovodní vody, aby byly řezy důkladně opláchnuté. Vypírání jsem ukončila ve chvíli, kdy řezy přestaly barvit vodu.
Protože jsem barvila větší množství preparátů (přes 300 podložních skel), bylo nezbytné občas vyměnit alkoholové roztoky a xylenové lázně. K výměně jsem přistoupila ve chvíli, kdy byla patrná změna barvy roztoků, xylen například získal nažloutlou barvu. Výměna samotných barviv nezbytná nebyla. V následujících odstavcích jsou uvedeny časy, které byly použity v průběhu barvení. Časy byly stanoveny na základě vlastních poznámek z předmětu Biologická a geologická školní technika.

Barvení Harrisovým hematoxylinem a eosinem

1) Odstranění parafínu a převod do vodního prostředí

Xylen I.                             5 minut
Xylen II.                           5 minut
Isopropanol 100%         5 minut
Ethanol 96%                   5 minut
Ethanol 80%                   5 minut
Destilovaná voda          5 minut

2) Barvení

Harissův hematoxylin     5 minut
Opláchnutí ve vodovodní vodě – krátce do zmodrání řezů
Diferenciace okyseleným alkoholem (50ml ethanolu 80% s přídavkem 20 – 30 kapek 10% HCl)     20 – 30 sekund
Opláchnutí ve vodovodní vodě
Eosin (0,1%)                     3 minuty
Opláchnutí ve vodovodní vodě

3) Odvodnění

Ethanol 80%                    5 minut
Ethanol 96%                    5 minut
Isopropanol 100%          5 minut

4) Prosycení xylenem

Xylen I.                            5 minut
Xylen II.                           5 minut

5) Zamontování do kanadského balzámu

Barvení Massonovým trichromem (upraveno podle Mourka, 2002)

1) Odstranění parafínu a převod do vodního prostředí

Xylen I.                              5 minut
Xylen II.                             5 minut
Isopropanol I. 100%       5 minut
Ethanol 96%                     5 minut
Ethanol 80%                     5 minut
Destilovaná voda            5 minut

2) Barvení

Harissův hematoxylin      5 minut
Opláchnutí ve vodovodní vodě – krátce do zmodrání řezů
Diferenciace okyseleným alkoholem (50ml ethanolu 80% s přídavkem 20 – 30 kapek 10% HCl)     20 – 30 sekund
Opláchnutí v destilované vodě
Červený barvící roztok (1% Poceau de xylidin + 0,5% kyselý fuchsin + 1% kyselina octová)       20 sekund
Opláchnutí v destilované vodě
Diferenciace kyselinou fosfowolframovou (1%)   15 minut
Zelený barvící roztok (1% světlá zeleň + 1% kyselina octová) 10 minut
Opláchnutí v destilované vodě

3) Odvodnění

Isopropanol II. 100%       5 minut
Isopropanol I. 100%        5 minut

4) Prosycení xylenem

Xylen I.                               5 minut
Xylen II.                              5 minut

5) Zamontování do kanadského balzámu